Dados do Trabalho

Título

PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO PCR-RFLP PARA IDENTIFICAÇÃO DO GENÓTIPO A2A2 EM BOVINOS LEITEIROS

Introdução (obrigatório)

A proteína do leite bovino, beta-caseína, possui variantes A1 e A2. Estudos indicam que a beta-caseína A2 é mais benéfica à saúde humana do que a A1, porque durante a digestão, a variante A1 libera o peptídeo BCM-7 (beta-caseomorfina 7) , que associada a desconfortos gastrointestinais e outros problemas de saúde (HO et al. 2014). Por sua vez, a beta-caseína A2 não libera BCM-7, tornando-se uma alternativa para quem é sensível à A1. Assim, identificar vacas com genótipo A2A2 é fundamental para produzir leite A2, agregar valor a este produto e atender a demanda por públicos com restrições alimentares.

A técnica Reação em Cadeia da Polimerase seguida por Restrição Enzimática para avaliar o Polimorfismo de comprimento de Fragmentos (PCR-RFLP) é um ensaio que envolve a digestão de fragmentos de DNA amplificado com enzimas de restrição. Essas enzimas cortam o DNA em locais específicos, gerando fragmentos de diferentes tamanhos dependendo das variações polimórficas presentes na sequência analisada. A padronização desta técnica se faz necessária para garantir a reprodutibilidade dos resultados, permitindo o uso do ensaio nos programas de seleção de animais para o melhoramento genético.

Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi padronizar a PCR-RFLP para identificar o gene A2A2 em bovinos leiteiros, estabelecendo um método confiável para ser adotado nos programas de melhoramento genético do rebanho e/ou formação de lotes de animais produtores de leite A2.

Material e métodos (obrigatório)

     Este estudo foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais (CEUA) da UFMT (Processo n° 23108.056877/2023-57) e desenvolvido na Fazenda Experimental da Universidade Federal de Mato Grosso - Campus Cuiabá, localizado em Santo Antônio de Leverger, na qual dispõe de um setor de bovinocultura de leite. Foram coletadas amostras de pêlos de 19 animais em lactação.            Cada animal teve aproximadamente 40 folículos pilosos coletados, garantindo a integridade do bulbo capilar. As amostras foram identificadas, acondicionadas em envelope de papel e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia Molecular de Alimentos da Faculdade de Nutrição - UFMT. No laboratório foi cortado o excesso de pêlo em um comprimento de aproximadamente 0,5-1 cm. Os folículos pilosos foram colocados em microtubo eppendorf estéreis e armazenados no ultra-freezer a - 80°C até a realização da extração do DNA.      O DNA foi extraído de 30 folículos pilosos de 19 amostras de animais da raça girolando, seguindo o protocolo descrito no manual "Purificação de DNA total de unhas, cabelos ou penas" fornecido pela QIAGEN (2006), utilizando o kit DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen).      A quantificação de DNA foi realizada por Qubit 2.0®  fluorometer (Invitrogen). Para este efeito, foi utilizado o kit Qubit™ dsDNA HS (Invitrogen). A concentrações de DNA (ng/ul) foram determinadas obtendo uma média de 4,07 ng de DNA das 19 amostras analisadas.      O primer utilizado no presente estudo foi desenhado por Smiltina e Grislis (2018) e sintetizados pela (Thermo Fisher), a padronização baseou-se inicialmente no estudo de Mayer et al. (2021), adaptada às condições internas do laboratório e validada por comparação de nossos resultados com  a genotipagem dos mesmos animais, realizada por PCR em tempo real no laboratório Geneal Diagnóstico, credenciado pelo Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA).

Resultados e discussão (obrigatório)

      As condições padronizadas em nossas condições internas, permitiu amplificar a região polifórmica do gene CSN2 utilizando o primer forward 5′-CCTTCTTTCCAGGAACTCCAG-3′ e reverse 5'-GAGTAAGAGGAGGGATGTTTTGTGGGAGGCTCT-3. A amplificação do gene por PCR foi realizada em volume de 25 µl contendo uma concentração final de 100 mM de dNTP, 0,5 U, 1,5mM de MgCl2, 0,4 μM de primer forward, 0,4 μM reverso, 10x buffer e 4,07 ng de DNA. As condições de amplificação em termociclador modelo Veriti® (Thermo Fisher) foi realizado por etapa inicial de desnaturação a 95°C por 5 minutos, seguida por 37 ciclos incluindo uma etapa de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento 65°C por 1 minuto, extensão 1 min, extensão final 72°C por 8 minutos e resfriamento a 8°C.         Os produtos de amplificação (121 pb) da PCR foram digeridos usando a enzima DdeI, na concentração de 10 U. Para a digestão do produto da PCR, foi seguido o protocolo recomendado pelo fabricante. A mistura de reação constitui em: 10 μL da reação de PCR, 18 μL de H2O livre de nuclease, 2 μL de 10x tampão e 2 μL da enzima HpyF3IR (Dde I). A digestão foi realizada em um termobloco a 37°C por 6h.  O produto da PCR digerido foi visualizado em transiluminador ultravioleta em gel de agarose a 3% submetidos a eletroforese com 100 volts por 90 minutos.           A imagem à esquerda (Figura 1) mostra que as bandas de DNA apresentaram 121 pb correspondentes aos genótipos A1A1, A2A2 e A1A2, sem a enzima de restrição. Já a imagem a direita (Figura 1), mostra as bandas de DNA após digestão com a enzima de restrição Dde I, demonstrando uma diferenciação entre os homozigotos A2A2 e A1A1, com bandas de 86 pb e 121 pb, respectivamente. Os animais identificados como heterozigotos apresentaram bandas de 84 e 121 pb correspondendo ao genótipo A1A2.          A escolha pela enzima Dde I é fundamental para permitir o corte do fragmento amplificado no sítio específico, permitindo a distinção clara entre os diferentes genótipos (A2A2, A1A1, e A1A2). Nossos resultados estão de acordo com os resultados obtidos por Mayer et al., (2021) e foram validados em comparação com o laboratório Geneal Diagnóstico, permitindo genotipar 19 animais do rebanho leiteiro avaliado. Figura 1:Perfil de bandas de DNA de vacas com genótipo A1A1, A2A2, A1A2 utilizando a técnica de PCR-RFLP. Legenda: M - marcador de peso molecular 100 pb. Genótipo A1A1: fenótipo para leite A1; Genótipo A2A2:fenótipo para leite A2; Genótipo A1A2:  fenótipo para  leite A1A2.

Conclusão (obrigatório)

A técnica de PCR-RFLP esta devidamente padronizada e permite identificar o gene A2A2 mediante a amplificação de uma região polimórfica de 121 pb no gene CSN2 e sua digestão com enzima Dde I. Este ensaio, pode contribuir com os programas de melhoramento genético das propriedades rurais, pois seleciona animais com genótipos A2A2, viabilizando a formação de lotes de vacas produtoras de leite A2, o que permite agregar valor e atender a demanda por produtos lácteos destinados a públicos com restrições alimentares.